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由于miRNAs分子序列较小，仅20nt左右，没有真核生物特有的Poly(A)尾巴结构，采用传统Oligo dT引物和随机引物很难获得从miRNA到cDNA的反转录产物。我公司开发出一套全新的加A法miRNA反转录试剂盒，基于Peter改良的miR-Q技术，可以对成熟的miRNA同时完成加A反应和反转录反应，直接获得含有特异性tag和15(T)的cDNA产物（如图1所示）。该方法使得miRNA反转录与mRNA的反转录一样轻松。直接将提取的miRNA与反应缓冲液混合物混合，并置于PCR仪上1小时即可获得高浓度的、包含所有miRNAs分子的cDNA产物。获得的cDNA产物适用于miRNA荧光定量PCR试剂盒进行定量检测。


图1.Peter改良miR-Q检测原理图


图2.microRNA反转录方法比较

试剂盒组成：

组分	25T×20μL	100T×20μL
4×One-step miRNA RT Solution	125μL	500μL
10×miRNA RT Primer	50μL	200μL
RNase-Free H2O	1mL	1mL×2

储存：请置于-20℃，可保存2年，避免反复冻融。
注：如4×One step miRNA RT Solution出现沉淀属正常现象，可用手捂化，混合均匀后使用不影响实验结果。

特别说明：10×miRNA RT Primer引物为5'-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'，定量扩增用特异性上下游引物进行扩增，下图2是以hsa-miR-21为实例说明特异性上下游引物的设计方法（Biorab的microRNA荧光定量PCR试剂盒提供所有miRNA检测，货号：MTAXXXXX，所有引物均经过设计优化，详细请于引物列表中查询。如果您研究的miRNA分子不在列表中，请来信咨询，我们将及时给您优化设计）。


图3.技术原理图


图4.hsa-miR-21实例设计原理

操作方法：

• 按以下组分配制反转录反应液：
  

  组分		用量
  模板	miRNA	0.01～0.1μg
  	Total RNA	0.1～2μg
  4×One-step miRNA RT Solution		5μL
  10×miRNA RT Primer		2μL
  RNase-Free H2O		Up to 20μL

  
  
• 在PCR仪上按以下条件进行反应：
  

  温度	时间
  37℃	60分钟
  95℃	5分钟

  
  
• 获得cDNA产物后使用microRNA荧光定量PCR试剂盒（货号：MTAXXXXX）进行miRNA定量检测。使用该试剂盒反转录所得cDNA产物包含了样品中所有miRNA反转录产物，可用于多个基因的检测分析，可使用内参基因进行定量矫正。内参基因可选择使用RNU6B miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号：MTA01501)，适用于来源于人和鼠等哺乳动物的样品；RNU44 miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号：MTA01502)、RNU48 miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号：MTA01503)，适用于来源于人的样品；SnoRNA135 miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号：MTA01504)、SnoRNA202 miRNA荧光定量PCR试剂盒(货号：MTA01505)适用于来源于鼠的样品。我公司提供的内参扩增引物浓度均为10μM，每20μL反应体系中加入0.4～0.8μL。

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